Nació en Tréveris hacia el año 340 de una familia romana.
Todavía era catecúmeno, cuando por aclamación del pueblo fue elegido a la sede episcopal de Milán, el 7 de diciembre del 374. En cuestión de religión cristiana tenía que aprender casi todo, y se dedicó sobre todo al estudio de la Biblia con tanto empeño que pronto la aprendió a fondo. Pero Ambrosio no era un intelectual puro; era sobre todo un óptimo administrador de su comunidad cristiana. Fue un verdadero padre espiritual de los jovencitos emperadores Graciano y Valentiniano II y del temible Teodosio I, a quien no dudó en reprochar duramente, exigiéndole una penitencia pública como expiación por haber hecho asesinar al pueblo de Tesalónica para acabar con una revuelta. Ambrosio es el símbolo de la Iglesia que renace después de los duros años del ocultamiento y de las persecuciones. Por medio de él la Iglesia de Roma trató sin nada de servilismos con el poder político. Sus cualidades personales fueron las que le atrajeron la devota atención de todos. La actividad cotidiana de Ambrosio estaba dedicada a la dirección de su propia comunidad, y cumplía sus compromisos pastorales predicando a su pueblo más de una homilía semanal. San Agustín, quien fue un asiduo oyente de los sermones de San Ambrosio, nos cuenta en sus Confesiones que el prestigio de la elocuencia del obispo de Milán era muy grande y muy eficaz el tono de este apóstol de la amistad. Sus libros publicados que han llegado hasta nosotros son las rápidas transcripciones y reutilizaciones de sus discursos, poco o nada revisados. Sus famosos Comentarios exegéticos, antes de ser reunidos en volúmenes, habían sido predicados a la comunidad cristiana de Milán. En ellos se nota el tono familiar del pastor que se dirige con amable sencillez a sus fieles. En ellos se siente palpitar el corazón de un gran obispo, que logra suscitar conmovedora emoción en sus oyentes con argumentos llenos de emotividad y de interés. Como buen pastor le gusta enseñar cantos litúrgicos a su pueblo. Por eso compuso un buen número de himnos, algunos son todavía familiares en la liturgia ambrosiana. Fue él quien introdujo en occidente el canto alternado de los salmos. Entre sus escritos que no tienen relación directa con su predicación, recordamos el De officiis ministrorum, porque, recalcando el conocido texto ciceroniano y acogiendo todos sus elementos, demuestra que el cristianismo puede asimilar sin peligro de alterar el significado de la buena noticia esos valores morales naturales que el mundo pagano y romano en particular supo expresar.
Ambrosio murió en Milán el 4 de abril del 397.